Επιστήμες

Real Time PCR

Εκτύπωση Ηλεκτρονικό ταχυδρομείο

Η real-time PCR βασίζεται στην επαναστατική μεθοδολογία της ποσοτικής PCR και πρωτοεμφανίστηκε το 1993 από τον Higuchi και τους συνεργάτες του. Η real-time PCR, απλά αναφέρεται στη μεγέθυνση DNA με PCR που ελέγχεται ενώ συμβαίνει η μεγέθυνση. Το πλεονέκτημα της μεθόδου είναι η δυνατότητα που προσφέρει στον ερευνητή να καθορίζει καλύτερα το ποσό του αρχικού DNA στο δείγμα πριν τη μεγέθυνση με PCR. Τα τελευταία χρόνια η χρήση της γίνεται ολοένα και πιο ευρεία, εξαιτίας του αυξανόμενου αριθμού real-time PCR θερμοκυκλοποιητών στην αγορά και της επακόλουθης πτώσης των τιμών τους καθώς επίσης και των αντιδραστηρίων.
Η real-time PCR ή PCR στον πραγματικό χρόνο είναι μία ποσοτική αντίδραση PCR κατά την οποία η μεγέθυνση του DNA στόχου και η ανίχνευση του προϊόντος γίνονται ταυτόχρονα στο ίδιο σωληνάριο, διότι το προϊόν που παράγεται συνδέεται με φθορίζουσα χρωστική που ανιχνεύεται από το οπτικό σύστημα του ειδικού κυκλοποιητή που χρησιμοποιείται στη real-time PCR. Με το όργανο αυτό καταγράφεται η κινητική της μεγέθυνσης του DNA από την ένταση του σήματος του φθορισμού που αντανακλά το ποσό του συντιθέμενου νέου DNA. Έτσι μπορεί να μετρηθεί επακριβώς το ποσό του DNA.
Η real-time PCR μετράει τα προϊόντα PCR καθώς συσσωρεύονται ή μετράει σε πραγματικό χρόνο το ποσό των PCR προϊόντων σε σημείο όπου η αντίδραση βρίσκεται ακόμη στην εκθετική φάση χρησιμοποιώντας την τεχνολογία των φθοριζουσών χρωστικών. Συγκεκριμένα, κατά τη διάρκεια της αντίδρασης PCR, ένα κατώφλι- σήμα φθορίζουσας χρωστικής καθορίζει σε πιο σημείο όλα τα δείγματα μπορούν να συγκριθούν. Αυτό το κατώφλι υπολογίζεται ως συνάρτηση του ποσού του υπόβαθρου της φθορίζουσας χρωστικής και τελικά ο κλασματικός αριθμός των κύκλων PCR που απαιτούνται για να παράγουν αρκετό σήμα φθορίζουσας χρωστικής που θα φθάσει σε αυτό το κατώφλι χαρακτηρίζεται ως κατώφλι κύκλου (cycle threshold, Ct). Οι τιμές Ct εξαρτώνται απόλυτα από το αρχικό ποσό του δείγματος και είναι η βάση για τον υπολογισμό των DNA αντιγράφων ή των επιπέδων έκφρασης του mRNA (Εικόνα 1).

Εικόνα 1. Υποθετική γραφική παράσταση πολλαπλασιασμού σε πειράματα real-time PCR.


Η γραφική παράσταση πολλαπλασιασμού είναι η συνάρτηση του φθορισμού σε σχέση με τον αριθμό των κύκλων. Ως baseline ορίζονται οι κύκλοι PCR κατά τους οποίους το σήμα συσσωρεύεται μεν αλλά είναι κάτω από τα όρια ανίχνευσης από το μηχάνημα. Αυτό το σήμα χρησιμοποιείται για τη χάραξη του κατωφλιού. Το κατώφλι υπολογίζεται επί 10 φορές της κανονικής παρέκκλισης από το μέσο σήμα της χρωστικής της baseline. (The threshold is calculated as 10 times the standard deviation of the average signal of the baseline fluorescent signal.). Σήμα χρωστικής το οποίο ανιχνεύεται πάνω από το κατώφλι θεωρείται πραγματικό και χρησιμοποιείται για το καθορισμό του κατώφλι κύκλου (Ct) για ένα δείγμα. Οι τιμές του Ct καθορίζονται από τον κλασματικό αριθμό των PCR κύκλων, κατά τους οποίους το σήμα της χρωστικής είναι μεγαλύτερο από ένα ελάχιστο επίπεδο ανίχνευσης. Στη συνέχεια οι τιμές του Ct των διαφόρων δειγμάτων χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό της σχετικής ποσότητας του κάθε δείγματος.
Σε αυτή τη γραφική παράσταση η ενιαία γραμμή τέμνει το κατώφλι στον PCR κύκλο 18, ενώ ή κηλιδωτή καμπύλη στον κύκλο 20, υπάρχει δηλαδή μία διαφορά 2 κύκλων μεταξύ αυτών των δύο δειγμάτων ή διαφορά Ct = 2. Εξαιτίας της εκθετικής φύσης της μεθόδου PCR, η τιμή Ct μετατρέπεται σε μία γραμμική μορφή του 2 ή σε τετραπλάσια διαφορά. Αυτός ο υπολογισμός χρησιμοποιείται κατά τη σχετική ποσοτική αναλυτική μέθοδο.
(Ginzinger DG. Gene quantification using real-time quantification PCR: An emerging technology hits the mainstream. Experimental Hematology 30(2002) 503-512.)

Με τη real-time PCR, εκτός από την ποσοτική ανάλυση του προϊόντος της PCR, γίνεται και ποιοτική ανάλυση με βάση τη μελέτη της καμπύλης τήξης του προϊόντος (melting curve analysis), κατά την οποία οι μεγεθυσμένες αλληλουχίες μπορούν να χαρακτηριστούν με βάση το σημείο τήξης τους (Τm), το οποίο είναι συνάρτηση του μήκους και της σύνθεσης των βάσεων του προϊόντος. Το σημείο τήξης είναι μοναδικό για κάθε αλληλουχία και χαρακτηριστικό γι αυτήν(Εικόνα 2).

Εικόνα 2. Αποτελέσματα ανάλυσης της καμπύλης τήξης ενός θετικού και ενός αρνητικού μάρτυρα.
Ο θετικός μάρτυρας περιέχει το ειδικό PCR προϊόν με Tm =87.5 oC, ενώ ο αρνητικός περιέχει αφετηρίες και διμερή αφετηριών (primers dimmers) χαμηλότερο Tm =83 oC. a) Δεδομένα της καμπύλης τήξης. Η αρχική μικρή πτώση οφείλεται στη θερμοκρασία την εξαρτώμενη από το χρωμογόνο, ενώ η επόμενη απότομη πτώση αναπαριστά την διαδικασία τήξης του προϊόντος. b) Αναπαράσταση της κορυφής της τήξης από τα δεδομένα της καμπύλης της (a). (Wilhelm J, Pingoud A. Real –Time Polymerase Chain Reaction. ChemBioChem 2003, 4, 1120-1128.)

Η ικανότητα ελέγχου της προόδου του πολλαπλασιασμού του DNA σε πραγματικό χρόνο, η οποία επιτυγχάνεται κατά τη μεθοδολογία της real-time PCR, πραγματοποιείται με τη βοήθεια ειδικών χημικών αντιδράσεων και ανιχνευτών (probes). Σε γενικές γραμμές, χρησιμοποιούνται σημασμένοι ανιχνευτές διαφόρων τύπων, όπου ο καθένας έχει μοναδικά χαρακτηριστικά, αλλά η στρατηγική είναι απλή για όλους, δηλαδή πρέπει να προκαλέσουν μια αλλαγή κατά τον πολλαπλασιασμό του DNA. Σήμερα οι πιο κοινές μέθοδοι χημείας που χρησιμοποιούνται στη real-time PCR είναι: α) η SYBR green I χρωστική, β) οι ανιχνευτές υδρόλυσης ( Hydrolysis probes) και γ) οι ανιχνευτές υβριδοποίησης (Hybridization probes) (Εικόνα 3).

Εικόνα 3. Μέθοδοι real-time PCR. α) SYBR green I χρωστική, β) ανιχνευτές υδρόλυσης και γ) ανιχνευτές υβριδοποίησης.
(van der Velden VH, et al. Leukemia. 2003;17(6):1013-34)

Η απλούστερη μέθοδος είναι αυτή στην οποία το προϊόν PCR ανιχνεύεται με φθορίζουσες χρωστικές που συνδέονται στο δίκλωνο DNA. Το SYBR green I είναι μία τέτοια χρωστική, η οποία παράγει σήμα φθορισμού. Η ένταση του σήματος είναι ανάλογη του ποσού του DNA που υπάρχει στην αντίδραση. Επομένως η ένταση του σήματος σε κάθε βήμα της αντίδρασης PCR αυξάνει καθώς αυξάνει και η συγκέντρωση του προϊόντος. Το γεγονός αυτό παρέχει μία απλή και αξιόπιστη μέθοδο ελέγχου της real time PCR. Ακόμη ένα πλεονέκτημα της μεθόδου είναι η χρήση μη τροποποιημένων αφετηριών, η οποία διευκολύνει τον σχεδιασμό και την σύνθεση των αφετηριών με χαμηλό κόστος σε σχέση με τις άλλες μεθόδους real time PCR . Επιπλέον η SYBR green I επιτρέπει και ποιοτική ανάλυση, με βάση τη μελέτη της καμπύλης τήξης του προϊόντος, δεδομένου ότι κάθε προϊόν ανάλογα με το μέγεθος του έχει μια χαρακτηριστική θερμοκρασία τήξης (Tm). Η θερμοκρασία τήξης (Tm) μπορεί να χρησιμοποιηθεί επομένως ως διαγνωστικό στοιχείο, εφόσον η αναπαραγωγή του πειράματος γίνεται κάτω από αυστηρά καθορισμένες συνθήκες, αφού οι τιμές της θερμοκρασία τήξης (Tm) επηρεάζονται από:
• τη συγκέντρωση του χλωριούχου μαγνησίου,
• του DMSO,
• του δείγματος του DNA,
• της SYBR green I και
• το ρυθμό διακύμανσης της θερμοκρασίας κατά την ανάλυση της καμπύλης τήξης.
Το κύριο μειονέκτημα της χρωστικής SYBR green I είναι ότι συνδέεται και στα μη ειδικά προϊόντα, οπότε πρέπει να γίνεται σαφής διαφοροποίηση μεταξύ των ειδικών και μη ειδικών προϊόντων, όταν χρησιμοποιούμε ανάλυση της καμπύλης τήξης.
Μεγαλύτερη ειδικότητα στη real-time PCR επιτυγχάνεται με την χρήση ολιγονουκλεοτιδίων ανιχνευτών (oligoprobes), οι οποίοι είναι σημασμένοι με φθοριοχρώματα, ένα μόριο δότη και ένα μόριο απόσβεσης (quencher), και υβριδίζονται στο πρότυπο DNA. Μέθοδοι ολιγονουκλεοτιδικών ανιχνευτών είναι:
• οι Taqman probes (εικόνα 4),
• molecular beacons (εικόνα 5) και
• Scorpion primers (εικόνα 6) .
Από τις συνηθέστερες που χρησιμοποιούνται είναι οι Taqman ανιχνευτές. Η μεθοδολογία αυτή χρησιμοποιεί την 5΄-3΄ εξωνουκλεοτιδική δράση της Taq DNA πολυμεράσης, η οποία προσκολλάται στον διπλά- μαρκαρισμένο ανιχνευτή και του αποσπά το 5΄άκρο του. Ο Taqman ανιχνευτής σχεδιάζεται για να υβριδίζεται στο πρότυπο DNA μεταξύ των αφετηριών και όταν είναι υβριδισμένος δεν φθορίζει, διότι τα δύο μόρια στα άκρα του, δότης στο 5΄άκρο και μόριο απόσβεσης στο 3΄άκρο, βρίσκονται κοντά. Αντίθετα, όταν το μόριο δότης απομακρυνθεί κατά τη διάρκεια της αντίδρασης PCR από το μόριο απόσβεσης, φθορίζει έντονα. Η ένταση του φθορισμού είναι ανάλογη του προϊόντος της PCR που παράγεται.

Εικόνα 4. Σχηματική παράσταση real-time PCR με TaqMan αφετηρίες.
(Dorak MT)

Εικόνα 5. Σχηματική παράσταση real-time PCR με molecular beacons.
(Dorak MT)

Εικόνα 6. Σχηματική παράσταση real-time PCR με Scorpions αφετηρίες.
(Dorak MT)

Η εφαρμογή της real-time PCR απαιτεί ιδιαίτερη προσοχή
• στην ποιότητα του δείγματος,
• στο χειρισμό του οργάνου,
• στην επιλογή της μεθόδου (χημείας),
• στα αντιδραστήρια (Taq πολυμεράση) και
• στην αντικειμενικότητα ανάλυσης των αποτελεσμάτων.

Τα πλεονεκτήματα της real-time PCR, έναντι της απλής PCR, αλλά και άλλων μοριακών μεθόδων, είναι πολλά. Το πιο σημαντικό ίσως αναφέρεται στην ικανότητα υπολογισμού νουκλεϊκών οξέων με απίστευτο πλατύ δυναμικό εύρος (το λιγότερο 5 λογαριθμικές μονάδες). Η ικανότητα αυτή σχετίζεται με την ιδιαίτερα μεγάλη ευαισθησία που έχει η μέθοδος, στην οποία οφείλεται η ανίχνευση αντιγράφων νουκλεϊκών αλληλουχιών λιγότερων από πέντε (ίσως και μόνο ενός σε μερικές περιπτώσεις). Επιπλέον πλεονεκτήματα είναι ο μικρότερος χρόνος που απαιτείται για την αντίδραση με παράλληλη ανάλυση του αποτελέσματος, η υψηλή ακρίβεια, η επαναληψιμότητα εξαιτίας του αυτοματισμού της αντίδρασης και της ανάλυσης, η αποφυγή επιμολύνσεων, λόγω της εκτέλεσης της αντίδρασης σε ένα κλειστό υψηλής τεχνολογίας σύστημα ώστε να μην απαιτούνται χειρισμοί μετά την PCR για την ανάλυση του προϊόντος και να ελαχιστοποιούνται έτσι οι επιμολύνσεις στο εργαστήριο και τέλος η δυνατότητα ποσοτικοποίησης.
Η real-time PCR μπορεί να εφαρμοστεί τόσο σε παραδοσιακές όσο και σε νέες εφαρμογές, με πολύ μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα σε σχέση με την απλή PCR. Το γεγονός ότι η μέθοδος συλλέγει στοιχεία κατά την εκθετική φάση πολλαπλασιασμού του DNA, ανοίγει νέες προοπτικές για νέες εφαρμογές :
• Ποσοτικό προσδιορισμό μικροοργανισμών (π.χ. ιοί).
• Μέτρηση της έκφρασης κάποιων γονιδίων.
• Επαλήθευση πολλαπλασιασμού κάποιων γονιδίων (gene amplification).
• Αποτελεσματικότητα θεραπευτικής αγωγής (π.χ. νέα φάρμακα για τον καρκίνο).
• Ποσοτικό προσδιορισμό βλάβης στο DNA.
• Ανίχνευση παθογόνων μικροοργανισμών.
• Προσδιορισμό γονότυπου (genotyping).

Επιστημονική Διαδικτυακή Πύλη

Τηλέφωνο:
(+30)2392064040

Email:
Αυτή η διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου προστατεύεται από τους αυτοματισμούς αποστολέων ανεπιθύμητων μηνυμάτων. Χρειάζεται να ενεργοποιήσετε τη JavaScript για να μπορέσετε να τη δείτε.

Εδρα:

Καρδία Θεσσαλονίκης

ΤΘ 57500, Καρδία